脐带间充质干细胞
脐带间充质干细胞治疗疾病的原理:
1. 替代和修复死亡和受损伤的细胞。
2.激活休眠和处于抑制状态的细胞:
3. 旁分泌作用(分泌神经营养因子、抗凋亡因子等):
免疫调控机制:
4.促进细胞间电能力、电传导的恢复(如间充质干细胞分泌连接蛋白帮助细胞间连接、促进离子通道的开放等)。
干细胞治疗优势:
1.治疗范围广阔，无任何毒性;
2.避免排斥，无须深入了解疾病的致病机理；
3.治疗材料来源充足。
干细胞技术的应用前景:
干细胞技术可治疗传统药物或者手术方式难以治疗的重大疑难疾病，免除病人承受较大痛苦:成功应用于再生医学美容，在未来生物发展中具更广阔的运用前景。
操作原则:
1.要在无菌条件下，如生物安全柜或洁净工作台处理该产品;
2.操作人员在操作过程中注意穿戴防护服;
3.我们建议细胞的接种密度为25-4.0x104cells/cm2，具体数量请根据细胞状态加以调整。
复苏和培养:
脐带间质干细胞的复苏和培养:
1.准备好37℃水浴。
2.准备好人脐带间质干细胞完全培养基，温育到37℃。
3.在15 mL离心管中加入9 mL的人脐带间质干细胞完全培养基。
4.从液氧罐口取出冻存的人脐带间质干细胞，立即放入-80℃冰箱(目的是让进入冻存管的液氮稍加挥发)。
5.在-80℃放置2-3 min后，取出冻存细胞，将冻存管迅速放入37℃温水中，快速晃动使管中内含物尽快融化。仔细观察，待冻存管内含物完全融化后取出。
6.用70%-75%酒精消毒冻存管口的外壁。
7.在超净台中打开冻存管，用吸管将细胞冻存悬液移入装有9 mL完全培养基的15mL离心管中。在这一过程请尽可能避免产生气泡。
传代:
脐带间质干细胞的传代:
1.将人脐带间质干细胞完全培养基、PBS、0.25%EDTA预热至37℃。。 2.吸去培养液。
3.用PBS(T25培养瓶加入约3 mL，T75培养瓶加入约6 mL)洗涤细胞2-3次。注意不要损害贴壁的细胞。
4.吸去PBS。
5.加入0.25%EDTA(T25加入约1mL，T75加入约2-3mL)。轻轻旋转，使EDTA覆盖细胞表面，消
化，显微镜下观察到约70%-80%左右的细胞变圆后，用手轻拍培养器皿的壁使细胞脱壁。
6.当看到明显的细胞脱落下来，立即加入预热的完全培养基(T25培养瓶加入约3m，T75培养瓶加
入约6 mL)终止消化。
7.用吸管吸取液体，反复吹打培养器皿底壁，使细胞彻底脱离器皿底壁。吹打时动作不宜太猛，
尽量避免产生气泡。
8.将细胞悬液转移到15 mL的离心管中。
9. 250 g，离心5min。
10,小心弃去上清液。
11.加入2 mL完全培养基重悬细胞。吹打时动作不宜太猛，尽量避免产生气泡。
12.对细胞进行台盼蓝染色计数活细胞数量。
13.按照2.5-4.0x104个活细胞/cm2的密度来接种细胞。
14.加入适量的人脐带间质干细胞完全培养基，轻轻摇晃细胞培养器皿，使细胞均匀分布。
15.把细胞放入37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
换液:
脐带间质干细胞的换液:
1.传代后发现有很多死细胞，应该予以换液。
2.当人脐带间质干细胞的完全培养基pH值变酸时(培养液的颜色变黄)，而且此时细胞仍未可以传
代，则应该予以换液。一般来说，人脐带间质干细胞的换液间隔为2-3天。
（1）倾斜培养瓶，用移液管吸掉7mL培养上清液。
说明:吸掉培养上清液时，尽量不吸走未贴壁的组织块。
（2）加入7mL完全培养基，摇匀。
冻存:
脐带间质干细胞的冻存:
1.待细胞生长至可传代的密度，即可消化准备冻存。
2.细胞的消化。
3.对细胞进行计数。
4.消化后的细胞悬液经250 g离心5 min。
5.小心弃去上清。
6.用10%DMSO冻存液重悬细胞，并使细胞的密度为1x106个活细胞/mL(或希望达到的细胞密度)。
7.把细胞分装到冻存管(需提前做好标记或贴上标签)中，旋紧冻存管盖。
8.将封好的冻存管放进程序降温盒，再放入-80℃冰箱。
9.24 h后将细胞转移至液氮进行长期保存。
参考文献:
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