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RNA-seq实战--2小时

news 来源：原创 2024/5/19 16:31:03

这是原帖http://www.bio-info-trainee.com/2218.html
http://www.bio-info-trainee.com/2218.html
准备工作：

安装WSL，并将源换成国内源；

在D盘建立文件夹bs用来放生信软件，文件夹data用来放下载的数据，data下建立文件夹fastq用来放测序数据，gtf用来放注释文件，hg19用来放index文件，map用来放比对排序等文件。

1、数据下载

数据在GEO地址是：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE50177，可知RNA-Seq数据为：

Run Sample

SRR957680 siSUZ12_BiolRep2

SRR957679 siSUZ12_BiolRep1

SRR957678 siCtrl_BiolRep2

SRR957677 siCtrl_BiolRep1

for i in {77…80}; do wget ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov … /SRR/SRR957/SRR9576${i}/SRR9576{i}.sra; done

2、数据处理

（1）安装软件

wget https://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.g … 2-1-ubuntu64.tar.gz

tar -zxvf sratoolkit.2.8.2-1-ubuntu64.tar.gz

echo ‘PATH =$PATH:/mnt/d/bs/sratoolkit.2.8.1-1/bin’ >> ~/.bashrc

source ~/.bashrc

（2）将sra文件转化为fastq格式

for i in {77…80};do fastq-dump --gzip --split-3 -O /mnt/d/data/fastq -A /mnt/d/data/SRR9576${i}.sra;done

（3）下载安装FastQC软件

sudo apt install fastqc

（4）对fastq文件进行质控

ls *.gz | while read id; do fastqc $id -o /mnt/d/data/fastqc -t 4; done

3、序列比对

（1）下载index文件：

wget -c ftp://ftp.ccb.jhu.edu/pub/infphilo/hisat2/data/hg19.tar.gz

tar zxvf hg19.tar.gz

（2）下载安装hisat2软件

sudo apt install hisat2

（3）正式比对

for i in {77…80};do hisat2 -t -x /mnt/d/data/hg19/genome -U /mnt/d/data/fastq/SRR9576{i}.sra.fastq.gz -S /mnt/d/data/map/SRR9576{i}.sam;done

（4）下载安装SAMtools软件

sudo apt install samtools

（5）SAMtools转换为bam排序

for i in {77…80}; do samtools view -S SRR9576{i}.sam -b > SRR9576{i}.bam; samtools sort SRR9576{i}.bam -o SRR9576{i}_sorted.bam; samtools index SRR9576${i}_sorted.bam; done

4、reads计数

（1）下载安装HTSeq-count软件

sudo apt-get install python-numpy python-matplotlib python-pysam python-htseq

（2）下载注释文件

wget ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/genco … 7.annotation.gtf.gz

gzip -d gencode.v26lift37.annotation.gtf.gz

（3）htseq-count计数

for i in {77…80}; do htseq-count -s no -f bam /mnt/d/data/map/SRR9576{i}_sorted.bam /mnt/d/data/gtf/gencode.v30lift37.annotation.gtf > /mnt/d/data/map/SRR9576{i}.count; done

（4）合成表达矩阵（在R中操作）

（i）分别读取count文件

options(stringsAsFactors = FALSE)

m_control_1<-read.table(“d:/data/map/SRR957677.count”,sep="\t",col.names=c(“gene_id”,“m_control1”))

m_control_2<-read.table(“d:/data/map/SRR957678.count”,sep="\t",col.names=c(“gene_id”,“m_control2”))

m_case_1<-read.table(“d:/data/map/SRR957679.count”,sep="\t",col.names=c(“gene_id”,“m_suz1”))

m_case_2<-read.table(“d:/data/map/SRR957680.count”,sep="\t",col.names=c(“gene_id”,“m_suz2”))

（ii）按照gene_id合并

m_raw_count<-merge(merge(m_control_1,m_control_2,by=“gene_id”),merge(m_case_1,m_case_2,by=“gene_id”))

write.csv(m_raw_count,file=“d:/data/map/m_raw_count.txt”,quote=FALSE,row.names=FALSE) #见附件

（iii）简单分析

summary(m_raw_count)