Jackson ImmunoResearch通过 SDS-PAGE 进行蛋白质分离

Jackson公司SDS-PAGE 进行蛋白质分离前言：

一旦准备好，样品蛋白质通过 PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离，这可以在天然或变性条件下进行。蛋白质印迹指南的这一部分详细介绍了您在分离蛋白质时可能需要考虑的事项。

SDS-PAGE 通常用于蛋白质印迹，其中蛋白质被变性和还原以获得它们的初级结构。用 SDS 分子（十二烷基硫酸钠）包被会产生与其分子量成正比的相对负电荷，从而允许仅按大小分离蛋白质。Native PAGE 省略了 SDS 的使用，用于观察不同的蛋白质特征。它很少通过蛋白质印迹进一步处理，更常见的是用考马斯或银染色。天然 PAGE 中的蛋白质迁移率取决于电荷和流体动力学大小，这由多肽折叠决定。以特定方式折叠的小蛋白质可能比更大、更紧密折叠的多肽具有更大的流体动力学尺寸。此外，可以保留多聚体结构。

SDS-PAGE 是通过将蛋白质引入丙烯酰胺凝胶基质并施加电流将带负电荷的蛋白质拉过凝胶来进行的。丙烯酰胺凝胶基质的密度阻碍了蛋白质的转运。较小的蛋白质比较大的蛋白质更快地通过凝胶，在电泳期间通过凝胶更远，并且看起来更接近凝胶的末端。相反，较大的蛋白质抵抗迁移并保持更接近凝胶的开始。包含已知大小蛋白质的蛋白质标记可以与样品同时加载，以校准分离蛋白质的大小。

也可以使用其他类型的凝胶，这些凝胶通过大小以外的特性分离蛋白质。例如，等电聚焦凝胶 (IEF) 凝胶根据蛋白质的等电点 (pI) 分离蛋白质，该等电点对应于蛋白质不带净电荷的 pH 值。除了凝胶本身之外，这些其他类型的凝胶通常还需要专门的缓冲液和分子量标记。

将蛋白质样品装入样品孔中，在夹在两个缓冲液室之间的聚丙烯酰胺凝胶中形成细齿。垂直电泳仪如图 1 所示。

个室连接到阴J，样品加载孔暴露在此处，第二个室连接到凝胶末端的阳J。施加电压，蛋白质通过凝胶向阳J移动。 

蛋白质大小和凝胶基质的密度决定了分离的速度；较小的蛋白质比较大的蛋白质迁移得更快。

准确的蛋白质鉴定和定量需要高质量的分离。必须使用适当的凝胶特性和上样浓度来确保充分分离。

Jackson公司：聚丙烯酰胺凝胶

聚丙烯酰胺凝胶用作分离基质。

坚固、亲水、热稳定、透明和相对化学惰性，这确保了在过程中不会破裂或熔化，并且蛋白质很容易观察到。

化学反应不会干扰蛋白质迁移，并且由凝胶密度控制的孔径可以变化。

不连续聚丙烯酰胺凝胶

PAGE 中使用的大多数凝胶由两个凝胶区域形成：由较低密度凝胶制成的浓缩凝胶和较高密度的分离凝胶。

较小的蛋白质通过浓缩胶快速迁移，并阻碍了通过分离胶的迁移。

较大的蛋白质通过浓缩胶缓慢迁移，可能不会渗透到分离胶中。

梯度凝胶

梯度凝胶用于允许在同一测定中分离不同分子量范围的蛋白质，从而允许从同一样品中分离低分子量和高分子量蛋白质。凝胶的选择取决于所需的蛋白质分离。

聚合和浇注凝胶

聚丙烯酰胺凝胶是通过化学或光引发聚合丙烯酰胺单体和 N,N'-亚甲基-双丙烯酰胺交联剂的溶液制成的。聚合的化学引发使用过硫酸铵等化合物引发反应，使用 N,N,N',N'-四亚甲基二胺等化合物来稳定链式反应。聚合的光引发使用核黄素，将其添加到溶液中并暴露在玻璃板之间的长波紫外线下，并用水饱和的丁醇覆盖。这不包括抑制链式反应的分子氧。

凝胶的密度由丙烯酰胺单体和双丙烯酰胺交联剂的浓度决定。增加丙烯酰胺浓度会增加凝胶密度。有多种厚度的预制凝胶可供选择，但手工浇注凝胶是博士学位。通过仪式。

高分子量蛋白质

PAGE 可用于分离 5 至 200 kDa 的蛋白质。对于大分子量蛋白质（700–4,200 kDa），琼脂糖凝胶比聚丙烯酰胺凝胶提供更好的分离。（表一）

Jackson公司：缓冲液 pH

pH 影响蛋白质迁移；因此，运行缓冲液的 pH 值必须高于蛋白质的等电点，以保持其净负电荷，因此它们向阳J移动。连续密度凝胶在两个腔室中使用相同的缓冲液，而不连续凝胶则需要不连续的缓冲系统。通常使用 Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶 pH 值约为 7.0，分离胶 pH 值介于 8.0 和 9.0 之间。需要时可以使用其他专门的缓冲系统。例如，在分离J低分子量的蛋白质/肽时，Tricine 缓冲液是理想的选择。

在高 pH 分离凝胶中，半胱氨酸残基之间可以形成二硫键。为了解决这个问题，可以将还原剂添加到缓冲液中。如果正在执行天然 PAGE，则可以添加缓冲范围为 7.4 至 8.8 的两性离子氨基酸，例如曲辛碱，作为替代溶液。

Jackson公司：用分子量标记确定蛋白质大小

蛋白质大小根据分子量标记进行校准。这些由一系列具有已知分子量的蛋白质组成，这些蛋白质与样品同时在平行通道中运行。

未知多肽的分子量可以通过计算标记物的相对迁移距离 (Rf) 与感兴趣的蛋白质行进的距离相比较来估计。分子量标记也是蛋白质转移效率的有用指标。

预染分子量标记可用于监测电泳过程中蛋白质迁移的进程。在添加免疫试剂之前，还可以通过用染料（例如丽春红 S）暂时染色膜来观察标记物。如果凝胶不进行免疫印迹，可以在电泳后用考马斯亮蓝或银染色来观察未标记的标记物。（表二）

阴性组织对照

阴性对照使用已知不表达靶蛋白的细胞或组织样本。当这些与未知样品一起运行时，不应检测到与目标蛋白大小相同的对照带。运行阴性对照以识别一抗的非特异性检测。阴性对照信号表明一抗与样品中的蛋白质相互作用，而不是感兴趣的蛋白质，例如培养过程中产生的内源性蛋白质。

另一种有用的阴性对照是免疫印迹，其中一抗被排除在外，通常称为无一抗对照。此类对照中的阳性信号表明二抗与样品中的蛋白质直接结合。例如，如果样品中含有小鼠 IgG，则使用小鼠组织样品的蛋白质印迹可能会产生阳性信号，这将被抗小鼠 HRP 偶联的二抗检测到。

加载控件

上样对照用于评估 PAGE 的一致性，它们产生的信号可用于在定量过程中使孔之间的测定结果标准化。

上样控制的一种形式是测量来自每个样品中掺入的蛋白质的信号。这可用于确认在电印迹过程中从凝胶均匀转移到膜上，并可用于在分析过程中使孔之间的信号标准化。在组成样品的组织或细胞中表达的管家蛋白，例如肌动蛋白，可用作上样对照。特别是，他们确认孔中装载了相同数量的样品，并且可以识别样品处理差异。